特定の官能基の可動性が制限されているため、抗力が低下します。

May 21, 2023

Scientific Reports volume 6、記事番号: 22478 (2016) この記事を引用

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156 オルトメトリック

メトリクスの詳細

現在利用可能な最も一般的ながん治療は放射線療法と化学療法です。しかし、これらの治療法には、生活の質の低下や多発性転移の場合の放射線療法の効率の低さなどの欠点があります。これらの影響を軽減するために、当社は抗がん剤を生体適合性マトリックスにカプセル化しました。インビトロアッセイでは、このバイオナノ複合材料が相互作用してがん細胞に形態学的変化を引き起こすことができることが示されています。一方、単球と線維芽細胞では変化が観察されず、このシステムがクリアランス率と毒性を低下させながら生体に薬物を運ぶ可能性があることを示しています。 X 線と中性子を使用して、担体の構造を調査し、バイオナノ複合材料内の薬物の移動度を評価しました。これらのユニークなデータから、薬物分子の活性基の部分的な移動制限が、このキャリア設計が健康な細胞にとってより安全である可能性がある理由を示唆していることを示します。

がんは世界的な公衆衛生上の主要な懸念事項の 1 つです。ヨーロッパでは、この病気の発生率は 2008 年の新規症例数 320 万人から 2012 年には 345 万人に増加しており、死亡率は約 50% です 1,2。パクリタキセル (PTX) は、乳がん、肺がん、卵巣がんの治療に現在利用できる最も効果的な薬剤の 1 つです3、4、5、6。その機能は細胞微小管の安定化に関わる独特のメカニズムに基づいており、これが治療上の成功を説明しています7。しかし、主にその低い水溶解度 (~0.4 μg/mL) と、当然のことながら健康な細胞に対する毒性により、この薬剤に関しては依然としてかなりの制限が存在します。溶解度を高めるために、薬物は無水エタノールやポリオキシエチル化ヒマシ油などの有機溶媒に配合されることがよくあります。残念ながら、このアプローチは過敏反応や高脂血症などの多くの副作用を引き起こします8。

したがって、抗がん剤を収容および送達するためのシステムの開発または修正が最も重要です9。有望な代替案は、薬物の薬物動態および生体内分布を制御するための可溶性ポリマーナノキャリアの使用である10。特に、生体高分子キトサンは、その生体適合性と生分解性により、生物医学用途で大きな関心を集めています11。このパスは PTX のカプセル化マトリックスとしても使用され、有望な結果が得られています 12、13。薬物送達システムの表面特徴を低毒性化合物で修飾することでさらなる改善が可能であり、これにより癌細胞へのキャリアの接着を増加させることも可能になる可能性があります14。この目的を達成するには、人間の骨や歯の主な無機成分であるヒドロキシアパタイト (Ca10(PO4)6(OH)2、以下 HAP) の使用が優れた候補です。ナノスケールでは、HAP は特別な生体適合性だけでなく、非免疫原性、非炎症性挙動、高い骨伝導性、およびさまざまな種類の癌細胞への良好な接着性を示します 15,16。さらに興味深いことに、HAP ナノ粒子 (nHAP) は、がん細胞の増殖に対して抑制効果を示しますが、健康な細胞に対しては効果が低いことが示されています 16、17、18、19。その結果、nHAP の特性とナノ複合材料中の生体高分子の組み合わせにより、癌細胞に対して固有の効果をもたらす薬物送達システムが得られる可能性があります。ただし、nHAP の特性を最大限に活用するには、これらのナノ粒子が複合材料の外層に存在する必要があります 20。生体高分子とnHAPの組み合わせから得られる利点に加えて、磁気特性を備えたナノキャリア、たとえばMn-Znフェライトナノ粒子に薬物を組み込むことにより、驚くべき新たな可能性がもたらされます。たとえば、外部磁場を使用して薬物担体を身体に沿って誘導したり、勾配計や磁気共鳴画像法によってその位置を監視したりする21、22、23、24。最後に、放射線療法や化学療法と組み合わせて使用される有望な技術である磁気温熱療法も実用化されています 25,26,27。

上記の考えに従って、キトサンでコーティングされたMn-Znフェライトナノ粒子から形成され、表面がnHAP28で修飾されたバイオナノコンポジット（以下、バイオNCPおよびバイオNCP+PTX）にPTXをカプセル化しました。

私たちのグループが開発した方法論に基づいて、走査型電子顕微鏡 (SEM) とエネルギー分散型 X 線分光法 (EDS) を使用して実施された形態学的 in vitro テストにより、細胞とナノ粒子の間の相互作用について予備的な洞察が可能になりました。ナノ粒子内の蛍光または放射性マーカー。この結果は、正常な単球と 2 つの異なるタイプの腫瘍細胞が bio-NCP と異なる相互作用を行うことを示唆しました。健康な細胞では毒性は観察されませんでしたが、形態学的変化は主に結腸癌細胞で検出されました。

製剤化されたバイオ NCP + PTX のやや困難な特性評価と、カプセル化および放出された薬物の動態に関する洞察は、それぞれ高度な顕微鏡法と分光法技術を使用して達成されました。これらには、近端 X 線吸収微細構造 (NEXAFS) 分光法、走査透過型 X 線顕微鏡 (STXM)、および非弾性中性子散乱 (INS) が含まれます。

NEXAFS は、磁性ナノ粒子が結果に影響を与えることなく、X 線と炭素原子の K シェルとの相互作用を利用して、さまざまな有機基を特徴付けることを可能にしました 29。 NEXAFS と STXM を組み合わせることにより、バイオ NCP の PTX 分布の視覚的分析とともに化学組成マップが得られました。これらの結果は、PTX が担体のポリマー部分内に分布していることを示しています。

最後に、カプセル化された薬物の動態と純粋な形の動態の比較（ポリマーと薬物の相互作用を理解および制御するための重要なステップであり、臨床試験に向けたこの技術のさらなる開発における主要な疑問の 1 つ）は、以下によって得られました。 INS と密度汎関数理論 (DFT) 計算を組み合わせます。これらの結果は、薬物キャリア内で観察される振動モードを含む振動モードの割り当てを提供しました 30、31、32。このアプローチを使用して、フェニルおよびアセチルの振動モードはカプセル化によって制限されているにもかかわらず、薬物放出後に回復するように見えることを示します。 PTX 活動はこれらのグループの移動性に関連していることが知られているため、これは重要です 7。

結論として、我々の一連の結果は、提案されたバイオ NCP が薬物送達の新興分野に新たな機会を開く可能性があることを示しています。

PTX キャリアとしてのバイオ NCP の可能性は、単球を用いた in vitro 試験によって強調されています。単球は、人体内の異物や分子の貪食を促進し、標的組織への到達を阻止する傾向があります。

健康なドナー（対照群）からの単球の形態学的変化（図1（a））を、純粋なフェライトナノ粒子（図1（b））およびバイオNCPとの2時間の接触に応じて視覚的に評価しました。 SEMによる（図1(c)）。どちらの場合も、大きな形態学的変化は観察されませんでした。続いて、バイオNCPのコアを構成するMn-Znフェライトナノ粒子の主成分であるFe濃度が高い領域を特定するために、細胞をEDSで分析した。このような観察により、細胞とナノ粒子間の相互作用についての洞察が得られます。これは実際、Mn-Zn フェライトを用いたアッセイの場合に当てはまり、図 1(b) に示すように、代表的な SEM 顕微鏡写真で緑色にマークされ、矢印で強調表示されている高 Fe 濃度の細胞が観察されました。このシナリオは、バイオNCPでナノ粒子を修飾することによって変化し、図1(c)に示すように、アッセイ後の細胞のFe濃度が低くなります。このことは、nHAP で修飾された生体高分子コーティングが、キャリアの機能を損なうことが知られている防御細胞からの反応を阻害することを示唆しています 33。

健康なドナー（対照群）の正常単球（a）と、Mn-Znフェライトナノ粒子（b）またはバイオNCP（c）のいずれかと2時間接触させた後の細胞の代表的なSEM画像とEDS分析。緑色でマークされた高い Fe 濃度は、Mn-Zn フェライトナノ粒子からの取り込みを示唆しています。

図 2(a) は結腸癌細胞 (上) と肺癌細胞 (下) の対照群の代表的な SEM 画像を示し、図 2(bc) は Mn-Zn フェライトおよびバイオ NCP ナノ粒子と 2 時間接触させた後の細胞を示します。それぞれ。緑色のスポットで示されているように、セルは EDS 分析にも供されました。これは、純粋な Mn-Zn フェライトナノ粒子でテストされたセルでより明らかです (図 2(b))。

結腸 (HCT116) および肺 (3LL) 癌細胞 (対照) (a) および Mn-Zn フェライト (b) およびバイオ NCP と 2 時間接触させた後の細胞 (c) の in vitro 分析の代表的な SEM 画像および EDS 分析）。緑色のスポットは、EDS によって測定された Fe 濃度が高い領域を示し、挿入図は選択された領域のズーム画像を示しています。結腸癌細胞は、Mn-Zn フェライトとバイオ NCP の両方と接触した後に最も明白な形態学的変化を示します。

さらに、各図では、細胞の形態学的変化を強調するために、選択した領域の拡大画像を挿入図に示しています。これらの変化は、セルのアスペクト比の分布を比較することによって評価されました。セルのアスペクト比とは、Mn-Zn フェライトとバイオフェライトとの接触の前後で、各セルの形状を表す楕円の長軸と短軸の比を指します。 NCP ナノ粒子。これらの線の下で、1 に近いアスペクト比分布は、主に球形の形状を持つセルを示します。これらの結果を図 3 に示します。これらの分析から、結腸および肺の対照群についてそれぞれ 1.9 および 1.5 の平均アスペクト比が得られます。興味深いことに、結腸癌細胞と Mn-Zn フェライトおよびバイオ NCP の両方との接触後、細胞のアスペクト比の分布は約 26% の減少を示し、平均値 1.4 に達しました。肺細胞には検出可能な変化は検出されません。

アスペクト比分布は、(a) 結腸 (HCT116) および肺 (3LL) 癌対照細胞、および (b) Mn-Zn フェライトおよび (c) バイオ NCP と 2 時間接触した後の細胞のバーで表されます。形態学的変化は、Mn-Zn フェライトとバイオ NCP の両方と接触した後の結腸癌細胞でより顕著であり、よりシャープな分布によって反映されます。各図において、記号はアスペクト比の累積頻度を表します。

最後に、バイオ NCP + PTX を含む材料の健康な細胞に対する予備的な細胞毒性試験が、ISO 10 993-5 の推奨に従って、線維芽細胞を用いた in vitro アッセイによって提供され、ここでは健康な細胞のモデルとして採用されました。。図 4 に示すように、アッセイ後の線維芽細胞の生存率は、対照グループで得られた結果と比較して有意な差を示さず、有意な毒性がないことを示しています。

Mn-Zn フェライトナノ粒子、バイオ NCP および複合バイオ NCP + PTX と接触させた 24 時間後の線維芽細胞の生存率テストでは、重大な毒性は示されませんでした。

対照サンプルは、いかなる物質とも接触していない線維芽細胞であることに注意してください。

図 5(a) に示されている PTX および bio-NCP の NEXAFS スペクトルは、炭素結合のかなりの柔軟性のため、励起の畳み込みによって拡大されています 34。それにもかかわらず、283.3 eV の PTX フィンガープリントは明確に検出され、芳香環の特徴である CC π* 結合に関連している可能性があります。 bio-NCP のスペクトルの 286 eV のピークは、C-OH 結合の C1s → σ* 遷移に関連している可能性がありますが、291 eV の広いバンドは、C-OH 結合からの C、H、および N 結合の励起に割り当てられます。架橋キトサン３４． 347 eV の bio-NCP スペクトルの注目すべきピークは、Ca L3,2 エッジに関連しており、キトサン表面のアパタイト修飾を示しています 35。

PTX およびバイオ NCP の NEXAFS スペクトル (a)。 PTX スペクトルは 283 eV に特徴的なピークを示しますが、bio-NCP スペクトルは 286 eV、291 eV、および 347 eV に特徴的な遷移を示します。 (b) は、275 eV、283 eV、286 eV、300 eV、 320 eV と 347 eV。 PTX は黄色、バイオ NCP は赤色で表され、青色は磁性ナノ粒子を含む背景物質に対応します。緑色のスポットは、PTX 濃度が低い領域を示します。組成マップは、ポリマー nHAP シェル内の PTX の分布を示しています。

図 5(b) は、STXM データから得られた化学組成マップを示しています。このマップでは、PTX は黄色で表され、バイオ NCP は赤色で表されます。青色は磁性ナノ粒子を含む背景物質を表します。黄色と青が混ざった緑色のスポットは、PTX 濃度が低い領域を示します。得られた画像は、バイオナノ複合材料のコアを形成する Mn-Zn フェライト磁性ナノ粒子とともに、薬物がキトサン/nHAP シェルに沿って分布していることを示しています。この分布により、薬物のカプセル化が成功したことが確認されます。

バイオ NCP + PTX を水性媒体に長時間さらした後の PTX の回復を検証するために、後者を 37 °C (人間の体温) で水に 7 日間分散させ、真空下、室温で乾燥させ、次の方法で調査しました。 FTIR。分散サンプル、調製されたバイオ NCP + PTX、および純粋な PTX に特有のすべてのスペクトル特徴は、気相分子の DFT 計算の結果と比較され、補足情報で詳細に説明されています。最も顕著な結果は、ベンゼン環に割り当てられた 1535 および 1550 cm-1 に位置するモードの観察でした。これらのモードは薬物放出後に回復し、PTX7 の抗腫瘍活性に関連します。

放出プロセスを解明するための次の重要なポイントは、薬物とその担体との相互作用の分析でした。このステップは、INS 実験と遊離分子の DFT 計算を組み合わせることによって達成されました。これらの計算の詳細は、純粋な薬物とカプセル化された薬物のアニメーションによるスペクトルの振動特徴の完全な同定を支援するものであり、補足情報に記載されています。計算は調和近似で実行されますが、材料の振動モード、特に低周波モードは非調和モードである可能性が高いことに注意してください。補足情報には、7 から採用された PTX 分子の概略構造も示されています。

図 6(a) では、56 cm-1 付近の鋭い最大値が H2O36 の音響モードに関連しています。ここで、この研究で使用された PTX は水和型と脱水型の混合物であることを思い出してください 37。 60 cm-1 を超えるモードは、PTX 分子のアセチル基とフェニル基に割り当てられ、カプセル化された PTX 分子のスペクトルに対応する (bio-NCP + PTX-bio-NCP) スペクトルでは検出されません。これは、分子が厳しく制限されているか、新しい立体構造に適応していることを示しています。ただし、矢印で示すように、PTX 分子に割り当てられたいくつかの高周波振動が (バイオ NCP + PTX-バイオ NCP) スペクトルに残っていることも明らかです。これらの振動は主にテルペン環自体の炭素および格子運動から発生し、カプセル化後も PTX の剛構造が維持されることを示唆しています。図6(b)に示すように、残りのメチル振動も200cm-1と270cm-1の間で検出されますが、300cm-1を超えるモードは、減算手順からの統計が不十分なため弱いように見えます。したがって、アセチル基とフェニル基の抑制は分子の折り畳みによる可能性が最も高いと結論付けられます。

INS データは、(a) 20 ～ 200 cm-1、(b) 200 ～ 500 cm-1 の FDS で収集されました。 (a、b) では、黒い曲線は PTX データを示していますが、黄色で示されているカプセル化薬物からの寄与は、(bio-NCP + PTX) スペクトルと (bio-NCP) スペクトルの差スペクトルによって示されています。 bio-NCP データは示されていません。フリー分子の DFT 計算により得られた INS スペクトルを緑色で示します。差分スペクトルでは、80 cm-1 以下で観察されるアセチル基とフェニル基に割り当てられたモードは検出されませんが、矢印で示されるテルペン環からの振動はカプセル化された薬物内で目に見えるままです。これは、PTX の生物学的に活性な基の移動性が高度に制限されていることを示しています。

我々の最初の in vitro アッセイでは、純粋な Mn-Zn フェライトナノ粒子またはバイオ NCP との接触後に単球に形態学的変化が観察されないことが示されました。しかし、Mn-Zn フェライトとの接触後、いくつかの単球は高い Fe 濃度を示しました。後者の観察は、単球による磁性ナノ粒子の相互作用および/または取り込みを示しています。一方、バイオ NCP で実施したテストでは非常に低い Fe 濃度が検出されましたが、これは原理的には純粋なフェライトと比較して Fe 濃度が低いことの結果である可能性があります。ただし、「方法」セクションで説明したこの実験の設定を考慮すると、バイオ NCP が単球の相互作用/取り込みを阻害すると考えるのが妥当です。結腸がん細胞および肺がん細胞を用いてさらにインビトロアッセイを行ったところ、Mn-Znフェライトナノ粒子とバイオNCPの両方が相互作用し、がん細胞、特に結腸由来のがん細胞に形態学的変化を引き起こすことが示されました。この仮定は、アスペクト比分布の変化に基づいて導き出されました。これは、当初は細長い細胞の特徴でしたが、相互作用後には球形の細胞を表すものに近づきました。結腸癌細胞株の浸潤性はその細長い形態と関連しているため、これは初期段階であっても心強い結果である 38。さらに、Mn-Zn フェライトナノ粒子とバイオ NCP の両方で観察された応答は非常に似ているため、バイオ NCP 効果の起源が磁気コアにあると仮説を立てるのは合理的です。実際、結腸由来のものを含むがん細胞に対する鉄ベースのナノ粒子の影響は、オートファジーと関連する細胞死を潜在的に引き起こす鉄触媒活性酸素種（ROS）の制御に起因すると考えられています39,40。したがって、この観察は、この特定の実験中にバイオ NCP のポリマー/アパタイトシェルを通じて Fe イオンが放出されることを示唆しているようです。一方、線維芽細胞に対する毒性の欠如は、低鉄濃度での健康な細胞に対する鉄毒性の減少に関連している可能性があります41,42。バイオ NCP + PTX は健康な細胞に対して無毒であると思われるため、これらはがん治療におけるバイオ NCP + PTX の応用に対する動機付けとなる結果です。しかし、これらの結果は、薬物がナノ複合材料中に非常に低濃度であるか、選択されたプロトコールの実験条件下では容易に放出されないことも示唆している。この質問に答えるには、バイオ NCP への PTX 濃度を調査する必要があります。バイオ NCP + PTX は複雑であるため、この作業はまったく簡単ではありません。そのため、HPLC (高速液体クロマトグラフィー) などの最も一般的な技術の適用が困難になり、より高度な固体を使用する必要が生じます。近づいてきます。したがって、NEXAFS と STXM を組み合わせることにより、バイオ NCP + PTX の化学組成のマップが得られました。このマップは、かなりの量の薬剤が実際にキトサンと nHAP シェル内に分布していることを示しており、PTX 放出の遅さはマトリックス内への閉じ込めによる可能性が最も高いことを示唆しています。

後者の観察は、閉じ込めが PTX ダイナミクスにどのような影響を与えるかを理解する必要があることを示唆しました。この質問は、INS と DFT を組み合わせることで解決されました。中性子と原子核の相互作用の単純さと、他の元素と比較して水素原子の非常に高いインコヒーレントな散乱断面積が、そのような理解の鍵でした 43。このような分析から、我々は、PTX の生物学的活性基、つまりアセチル基とフェニル基の移動性が、bio-NCP + PTX では高度に制限されていると結論付けました。したがって、キャリアは薬物と作用部位の間の物理的障壁としてだけでなく、分子の特定部分の動きを制限することによっても PTX の活性を制限していると仮説を立てることができます。しかし、FTIRによって観察されたように、放出後、これらの振動運動は部分的に回復し、抗がん剤が活性型を回復した可能性があることが示されました。

生存率と INS の結果から、生体内試験におけるバイオ NCP + PTX の将来の応用を構想する前に、薬物放出速度をより適切に制御する必要があることが明らかになりました。この問題を回避するための明らかなアプローチの 1 つは、バイオ NCP 構造の変更、つまりキトサンの架橋度や模倣度、あるいはポリエチレングリコールなどの異なる表面電荷分布を持つ別のポリマーの選択です。。それにもかかわらず、この方向に進む前に、がん細胞の周囲のバイオ NCP からの PTX の放出挙動の評価など、さらに考慮する必要がある問題がいくつかあります。健康な細胞と比較して固有のわずかに低い pH 環境は、キトサンネットワークを分解または弛緩させるのに十分である可能性があります 45,46。さらに、別の可能性として無線周波数の使用も検討する必要があります。この場合、磁性ナノ粒子 27 を加熱することでポリマーネットワークが緩和され、薬物の放出が促進される可能性があります。

結論として、我々は、PTX キャリアとしての新しいバイオ NCP の適用に関する有望な結果について報告します。また、理論計算と組み合わせた最先端の散乱技術に基づいて、カプセル化薬物の研究のための新しい方法論も提案します。この研究の次のステップでは、放出された PTX の動態に対するカプセル化の効果とその生物学的活性との相関、および薬物放出機構の最適化についてのさらなる理解に焦点を当てます。

bio-NCP を取得するための詳細な合成プロセスは、他の場所で説明されています 28。簡単に言うと、中性子回折結果 28 から、ナノ粒子 1 mg あたり 0.41 mg の Fe が塩溶液から沈殿し、その後ダブルエマルション法によってキトサンにカプセル化されたことが判明しました。次にキトサンはグルタルアルデヒドとの反応によって架橋され、最終模倣プロセスが実行されてアパタイトで表面が修飾され、バイオ NCP ナノ複合材料が形成されました。模倣効率に応じて、ポリマー表面に有効に存在するアパタイトの量に関係するため、容易に決定することはできませんが、最終的なバイオ NCP では、mg あたりの鉄の量は 0.20 mg (100% 効率) から0.27 mg (効率 0%)。バイオ NCP + PTX は、キトサンの架橋前に溶液に PTX を添加することを含む同様の方法で生成されました。したがって、Fe 含有量は bio-NCP + PTX と同様であると推測できます。詳細は補足情報に記載されています。

ヘルシンキ宣言に従って、健康なドナーの末梢血からヒト単球が分離されました。すべての健康なボランティアはインフォームドコンセントを提供しました。この研究は、Plataforma Brasil の健康研究倫理委員会 (http://aplicacao.saude.gov.br/plataformabrasil/login.jsf) によって承認され、決定番号 1358038 および CAAE 番号 50995715.9.0000.5411 が付けられました。兼野博士の研究室から提供された安定した癌細胞株を使用しました。したがって、地元の倫理委員会の承認は必要ありませんでした。細胞培養の調製に関する詳細なプロセスは補足情報に記載されています。調製後、細胞を 2 × 105 細胞/mL に設定し、あらかじめポリ-L-リジンでコーティングした丸いガラススライド (∅13 mm) に分注しました。スライド上での細胞の接着を促進するために、培養物を 5% CO2 下、37 °C で 2 時間保持しました。

スライドガラスを温かい完全培地（補足情報に記載）で３回（毎回１ｍＬ）洗浄し、５０μｇの純粋なフェライトまたはバイオＮＣＰナノ粒子のいずれかと相互作用させた。細胞表面とナノ粒子が直接接触できるように、細胞培養物を 5% CO2 下、37 °C で 2 時間保持しました。次いで、スライドを室温で新鮮なリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞単層を２．５％グルタルアルデヒドで固定し、以下のように顕微鏡分析にルーチン的に処理した。

スライド上に単層を固定した後、細胞を 7.5、15、30、50、70、90 および 100% のエタノール溶液で各アルコール濃度に対して 10 分以内に 2 回脱水し、超臨界乾燥（臨界点以上）にかけました。 ) CO2 雰囲気中でさらなる金属化を行います。その後、サンプルを走査型電子顕微鏡 (SEM) (FEI、Oxford, Inca、250P20 EDS を備えた Quanta 200) で分析し、スライドごとに 7 枚の画像 (倍率 1000 倍) をランダムに収集しました。セルのアスペクト比の分布は、ソフトウェア ImagePro 4.1.0.0 を使用して評価しました。細胞数を決定するための研究は行われていません。したがって、細胞数は最大値に正規化されました。 EDS を使用して、セル上の Fe 濃度をマッピングしました。ナノ粒子の量と機器パラメータは、Mn-Zn フェライトまたはバイオ NCP のいずれかの同じ質量に対して同じ信号/ノイズ比が得られるように設定されました。

純粋なフェライト、バイオ NCP およびバイオ NCP + PTX の毒性は、Balb/c 3T3 線維芽細胞 (クローン A31 – American Type Culture Collection) に関して次のように評価されました。まず、補足情報に記載されているように細胞を処理し、それぞれ 5 × 104 個の細胞を含む 96 ウェルプレートに分注し、24 時間培養しました。続いて、50 μg の各サンプル、つまり純粋なフェライト、バイオ NCP およびバイオ NCP + PTX を細胞の培養に使用したのと同じ培地に懸濁し、プレートに添加して細胞と相互作用させました。 24時間後、上清、つまり過剰な液体および磁性ナノ粒子を除去し、細胞をPBS-Aで洗浄し、3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムとのインキュベーションに供した。臭化物 (MTT) を 0.5 mg の MTT/mL の DMEM で 4 時間処理しました。これにより、生細胞内でホルマザン色素が形成され、これがDMSOに可溶化され、マイクロプレート光度計を使用して570 nmで読み取ることで定量されました。得られた吸光度の値は細胞の生存率を反映します。実験は、それぞれ an = 6 で二重に実行されました。

PTX およびバイオ NCP サンプルは、窒化ケイ素膜 (英国シルソン) 上に蒸着するためにエタノールに分散され、炭素 K 端光子エネルギー範囲 (250 ～ 350 eV) を使用する X 線分析のために低真空環境に置かれました。 PolLux ビームライン (スイス、ポール・シェラー研究所のスイス光源)47、48、49。 STXM 実験では、単色 X 線ビームがサンプルに焦点を合わせ、測定された透過強度を使用してピクセルごとの画像が構築されます。 X 線光子エネルギーを NEXAFS スペクトルに存在する共鳴特徴に合わせて調整すると、STXM 画像には、構成材料の分子結合に基づく自然なコントラストに関連する強力な特徴が表示されます。したがって、選択した光子エネルギーで取得した一連の画像を構成材料の NEXAFS スペクトルと組み合わせることで、特異値分解を使用してサンプルの化学組成マップが計算されます50。したがって、PTX とバイオ NCP の NEXAFS スペクトルが収集された後、バイオ NCP + PTX の STXM 画像が次の X 線エネルギーで取得されました: 275 eV、283 eV、286 eV、300 eV、320 eVそして347eV。画像とスペクトルは、aXis2000 ソフトウェアパッケージ 51 を使用して分析されました。

PTX、バイオ NCP、およびバイオ NCP + PTX の振動力学は、ロスアラモス国立研究所 (米国) のルハンセンターにある FDS 分光計を 10 K で使用して中性子分光法によって調査されました。この分光計を使用することにより、次のことが可能になりました。 50 ～ 500 cm-1 の間の分子運動を観察します。サンプルは密閉されたアルミニウム容器に取り付けられ、データを補正するためにバナジウム分析が使用されました。

0 K での気相パクリタキセル分子の構造最適化とその後の調和振動周波数の計算は、Gaussian0952 を使用して理論の B3LYP/6-31 + G(d') レベルで実行されました。開始原子位置は、参考文献に記載されている 2-カルバメートタキソールの結晶構造から取得されました。 53. 次に、プログラム a_climax54 を使用して、ガウス計算からの周波数と振動振幅を使用して、非弾性中性子散乱スペクトルの強度と振動スペクトルを計算しました。 PTX の FTIR スペクトルも計算され、1400 ～ 1900 cm-1 の範囲でのモード割り当てに使用されました。

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この研究は、ロスアラモス国立研究所のマヌエル・ルハン・ジュニア中性子散乱センターの利用と、エネルギー省基礎エネルギー科学局からの資金援助の恩恵を受けました。ロスアラモス国立研究所 (LANL) は、DOE 契約 DE-AC52-06NA25396 に基づいて、ロスアラモスナショナルセキュリティ LLC によって運営されています。 MLM と RI は、契約 05KS4WE1/6 および 05KS7WE1 を通じてドイツ大臣 für Bildung und Forschung (BMBF) から資金提供を受けている PolLux でのビームタイムのスイス光源に感謝します。著者らは、資金援助について FAPESP、CNPq、および DANSCATT に感謝します。 JE は、コンピューティングリソースを利用可能にしてくれた LANL の物質物理学および化学グループ (T-1) と、スロベニアのリュブリャナにある国立化学研究所でいくつかの計算を行ってくれた Jernej Stare 博士に感謝します。 Walter Kalceff 博士 (UTS、オーストラリア) にも、この研究に対する批判的なレビューと議論に対して感謝の意を表します。

ニールス・ボーア研究所、コペンハーゲン大学、DK-2100、コペンハーゲン、デンマーク

ムリーリョ・L・マーティンズ、ロザンナ・イグナッツィ、エロイザ・N・ボルダロ

生物科学研究所 – パウリスタ州立大学 – CP 510、18618-970、ボトゥカトゥ – SP、ブラジル

ムリージョ・L・マーティンズ、ラモン・カネノ、ウィリアン・F・ザンブッチ、マーガレット・J・サエキ

南フロリダ大学化学科、4202 E. Fowler Ave.、タンパ、33620、フロリダ州、アメリカ合衆国

ユルゲン・エッケルト

ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、87545、ニューメキシコ州、アメリカ合衆国

ユルゲン・エッカート & ルーク・デーメン

スイス光源、ポール・シェラー研究所、CH-5232、フィリゲン、スイス

ベンジャミン・ワッツ

ヨーロッパの核破砕ソース ESS AB、私書箱 176、SE-221 00、ルンド、スウェーデン

エロイザ N. ボルダロ

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MLM と HNB は、実験の設計、データ分析、原稿の執筆に関与しました。 MLM、RI、BW、RK、WFZ、LD、MJS が実験とデータ削減を実行しました。 JE は DFT 計算に関する専門知識を提供しました。この原稿は、現在のバージョンですべての共著者によって承認されました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Martins、M.、Ignazzi、R.、Eckert、J. 他特定の官能基の可動性が制限されると、健康な細胞における抗がん剤の活性が低下します。 Sci Rep 6、22478 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep22478

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受信日: 2015 年 6 月 29 日

受理日: 2016 年 2 月 8 日

公開日: 2016 年 3 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep22478

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